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研究概要
１．序（研究背景等）
現在、農業、食品、工業、環境分野において、種々の組換え生物が創生され、除草剤耐性、病虫害耐性、ウイルス耐性の組換え植物、また低温発酵性組換えパン酵母、酵素製造、医薬品製造組換え微生物等が実用に供されている。しかしながら一方では、組換えトウモロコシの標的外生物への毒性、組換え遺伝子の野生植物への定着等に起因する組換え生物のリスクが大きな関心事となっている。とりわけ2003年９月に生物多様性条約のなかのカルタヘナ議定書が国際発効し、これに伴いわが国において「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物多様性の確保に関する法律」が2003年６月に公布され、2004年２月に施行された。これまでわが国では、組換え生物の開放系利用のリスク評価に関しては、人に関するものが中心であったため、生物多様性への影響評価に関する知見がほとんどなく、かつ生物多様性への影響評価手法が確立していないのが現状である。有害物質を浄化する組換え微生物ならびに除草剤耐性組換え植物等が開発されている中で、生物多様性への影響において大変重要な評価項目と考えられる導入遺伝子の環境中における他の生物への移行の頻度とその機構並びにその評価手法の開発は、今回施行された法律の生物多様性影響評価法を補完するための基礎データを提供すると共に、組換え生物の生物多様性への悪影響を未然に防止することに役立つものとなる。
２．研究目的
現在、組換え生物の開放系利用に際して、宿主、導入遺伝子、組換え体のヒトへの毒性、毒素の生産性、雑草化等が評価項目として設定されているが、本研究ではこれらの項目以外に生物多様性への影響評価項目として重要と考えられる、遺伝子の環境拡散リスクならびに地域野生生物個体群への影響および健全な生物相維持への影響等についての新たな評価方法の開発を目的とする。特に、微生物と植物に着目して、研究を遂行する。微生物に関しては、組換え微生物の環境中での挙動を明らかにするためのマーカー遺伝子の開発、遺伝子発現応答による迅速な微生物多様性への影響評価手法の開発、導入遺伝子の微生物間や魚−微生物間の伝達頻度さらに組換え微生物の有用微生物群集構造への影響評価法を開発し多様性への影響を評価する。植物に関しては、野外における遺伝子移行の頻度とそのモデル化、ナタネ、アズキ、ダイズ等における導入遺伝子の近縁野生種への長期的な拡散と定着性、さらに遺伝子の移行に及ぼす環境要因について検討する。これらの結果を踏まえて、遺伝子組み換え生物の生物多様性への影響評価手法を開発する。それぞれのサブテーマの課題は、研究体制に記された通りであり、研究の全体の流れを図１に、微生物グループの研究目標を図２に、植物グループの研究目標を図３に示した。
３．研究の内容・成果
(1)遺伝子組換え微生物の微生物多様性への影響評価手法の開発に関する研究
�．沺璽�ー遺伝子を導入した組換え微生物の検出法の開発
環境浄化を目的とする組換え微生物が現段階で創製されており、実用化が期待されている。しかしながら、環境中に生息する様々な微生物の中から導入した微生物のみを検出、定量することは極めて困難である。そこで、汚染物質を分解する性質を付与した組換え微生物に、標識（マーカー）となるような特徴的な配列、及び遺伝子を導入し、環境中、特に類似の微生物や遺伝子が存在する状況においても特異的検出、及びその動態の追跡が可能となる手法の確立を目指した。宿主を追跡するため、大腸菌ゲノム上のrrnオペロン内の16S rRNAを標的にして、その配列内にgfp遺伝子（緑色蛍光タンパク）を挿入する技術を確立した。また、TCE分微生物の生残性や浄化活性を長期間に渡ってモニタリングする手法はまだ確立しておらず、環境中に存在する多種多解活性に関わる遺伝子について、その野生型とも区別可能な特異的検出を目指して、分解能を保持したマーカー配列の設計（同義置換）及び導入手法の確立、およびその導入を行った。このマーカー配列は野生型配列の存在下でもPCRなどを用いて特異的に検出することが可能であり、リアルタイムPCRを行うことによって特異的定量も可能となった。プラスミドの検出を可能とするため、機能遺伝子を含むプラスミドにdsred遺伝子（赤色蛍光タンパク）を導入し、プラスミドの有無を蛍光色の変化によって観察可能な系を構築した。以上より、TCE分解能を有する組換え体として、toluene-2-monooxygenaseを保持するPseudomonas putida KTTG39株を作成した。宿主の染色体にはgfp遺伝子、マーカーを導入した機能遺伝子（tom）を含むプラスミドにはdsred遺伝子を導入することによって、宿主、およびそのプラスミドの保持／非保持は、蛍光色の変化で識別が可能となった。さらにgfp、dsredについてもリアルタイムPCRを用いた特異的定量系を構築し、蛍光検出、分子遺伝学的検出の併用により精度の高い解析が可能となる組換え体を構築することが出来た。
��遺伝子発現応答の解析による迅速な微生物多様性の影響評価手法の開発
現在、わが国では組換え微生物の野外利用はなされていないが、近い将来環境浄化微生物等の有用な組換え微生物が開発あるいは海外より輸入され利用されていくと予想され、こうした組換え微生物の生態系影響をなるべく短期間で評価する技術の開発を目指し、模擬環境中に組換え微生物を接種し、土着の環境微生物細胞数およびその遺伝子に及ぼす影響の解析を行った。
霞ヶ浦（茨城県）の湖心から採取した湖水試料を用いてマイクロコズム（プラスティック製2L容三角フラスコ）を作成し、模擬環境とした。ここに環境中での挙動および微生物生態系への影響を評価するためにマーカー遺伝子（水銀還元酵素及びテトラサイクリン耐性）をコードしたプラスミド（pSR134）を導入した組換えPseudomonas putida PpY101/p SR134を接種した。また対照としてその宿主（非組換え微生物）を接種した系、さらに菌体を接種しない対照系を用意した。各マイクロコズムを暗所、20℃の恒温室に設置し、60rpmで緩やかに振とうして影響評価試験を実施した。経時的にサンプリングを行い、各種選択平板培地で一般従属栄養細菌、グラム陰性菌、シュードモナス属細菌、耐塩性菌、放線菌の環境微生物の菌数を計数した。この結果、組換えあるいは非組換え微生物接種のこれら環境微生物の菌数に及ぼす影響は認められず、これまで報告されている多くの知見と一致していた。
また、経時的にマイクロコズム中の環境微生物細胞を回収し、これら微生物細胞からDNAを抽出した。ついで、微生物の分類の指標となる16SrRNA遺伝子をターゲットとしてPCR法により増幅させ、微生物多様性を評価するためにDGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis; 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）分析を行った。PCR-DGGE分析によって得られたバンドパターンを詳細に解析し、本手法が再現性に優れており、微生物の多様性の評価に有用であることを確認した。さらに、多次元尺度法による統計処理による解析の結果、試験日数の経過とともに各系のバンドパターンは非常に類似していくことが認められた。
�Ｆ各�遺伝子の挙動解明と微生物多様性に及ぼす影響に関する研究
一般に組換え微生物の検出マーカーとして抗生物質耐性遺伝子が用いられているが、抗生物質耐性遺伝子が有害微生物に水平移行し抗生物質耐性になることが懸念されている。また、導入した遺伝子の挙動についても不明な点が多い。理想的には導入遺伝子が移行しないことが望まれる。本研究では、水環境および土壌環境中における組換え微生物から他の微生物への水平移行の有無および頻度、水平移行に及ぼす環境要因の影響について検討した。
まず、Pseudomonas属細菌および大腸菌の、環境中からのプラスミドの取込みを検討した。プラスミドpSR134と共にこれらの細菌を様々な条件の寒天培地に置いたメンブレンフィルター上に集積し、テトラサイクリン-HgCl2耐性コロニーの形成頻度を測定した（フィルター法）。高Mg2+濃度条件（１mM〜100mM：なお、河川水中のMg2+濃度は0.1mM程度）においてP. aeruginosaとP. alcaligenesで形質転換が観察され、その頻度は10-8程度であった。フィルター法でのプラスミド取り込みは、Mg2+濃度が高いほど、pSR134の添加量が多いほど高頻度になった。また、溶液中での移行（液体法）でも形質転換は観察されたが、その頻度はフィルター法よりも低下した。
次に不忍池と霞ヶ浦の湖水及び土壌中における微生物のプラスミドの取り込み頻度と取り込んだ細菌の同定を試みた。湖水中の微生物濃度が低いため細菌を遠心分離により濃縮して細菌懸濁液を調製し、これにpSR134あるいはP. putida PpY101/pSR134（霞ヶ浦試料水のみ）を添加して自然水中の細菌によるpSR134の取り込み頻度、pSR134を取り込む細菌種の同定を行った。液体法での形質転換頻度は2日目に最大（4.6×10-6）となり3日目には減少した。また、フィルター法での場合は1日目に最大（2.2×10-6）となりその後は減少した。液体法とフィルター法での形質転換頻度や単離された形質転換体の細菌種はほぼ同じであった。
液体法により不忍池湖水を用いて微生物10倍、100倍、1000倍濃縮液とプラスミドpSR134を0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml添加し、形質転換頻度・形質転換体の細菌種を決定した。細菌濃度が1.3×106cfu/ml未満の条件では形質転換体は検出されなかったが、それ以上の細菌濃度ではほぼ一定の頻度（1.8×1O-7〜7.4×10-7）で検出された。また、各条件で単離された形質転換体の細菌種は、細菌懸濁液の濃縮倍率によって変化することが示された。これは、試料水原水に低濃度でしか存在しない細菌種の場合は高い濃縮倍率で濃縮して初めて形質転換体が検出でさるからであろう。霞ヶ浦試料水では、100倍濃縮液に0.1μg/mlのpSR134を添加した条件でのみ形質転換体が検出された。形質転換頻度は1日後と3日後では10月採取の不忍池試料水の場合と同程度（1.6×10-7、5.8×10-7）であったが10日後では1.7×10-5に上昇した。
本実験により、不忍池試料水からは12種91株、近縁種はαプロテオバクテリアのLabrys methylaminiphilus（3種、33株）、Phodopseudomonas palustris（5株）、γプロテオバクテリアのDyella yeojuensis（23株〉、Stenotrophomonas meltophilia（16株）、霞ヶ浦試料水からは2種5株、αプロテオバクテリアのAfipia lausannensis（4株）、にpSR134取り込み細菌が単離された。
また、土壌試料における総細菌数・形質転換体数を計数したが、プラスミドの取り込み・伝達は検出されなかった。組換え微生物の自然環境での使用により組換えプラスミドが環境中に放出された場合、非常に低頻度ではあるが組換えプラスミドが環境中の微生物に取り込まれうることが示された。
�と�生物多様性に及ぼす組換え魚の影響に関する研究
遺伝子導入魚から細菌への遺伝子移行の可能性を検証する前提条件として、カナマイシン耐性遺伝子をコードしている純化したプラスミドpML4が代表的な腸内細菌である大腸菌（E. coli）や代表的土壌細菌シュードモナス（P. putida）に移行し、カナマイシン耐性を獲得しうるか否かを検討した。最も単純な実験系として、pML4とその適切なホストである大腸菌RR1との共存によって、大腸菌RR1が形質転換するかを調べるために、菌の状態としてもっとも形質転換し易い対数増殖期にpML4とRR1を共存させて形質転換するか検討した。その結果、RR1がカナマイシン耐性を獲得する頻度は9x1O8個に１個未満であることが示された。また、最も形質転換しやすいエレクトロポレーション法を用いても、pML4によりシュードモナスがカナマイシン耐性を獲得する頻度は、2.8x108個のうち１個未満であることが示された。
遺伝子導入ゼブラフィッシュを用いて、遺伝子導入魚から外来性遺伝子が腸内細菌に移行する可能性を検討した。腸内細菌はフンとして排泄されると考えられるが、フンから抽出されるDNA中に導入遺伝子が検出された。腸内細菌を好気培養すると、カナマイシン耐性コロニーが104/gフン乾燥重量のオーダーで生育してきたが、その一部を分離培養した菌株、および、全部まとめてかきとったサンプルどちらにも、導入遺伝子は検出されなかった。さらに、遺伝子導入ゼブラフィッシュ腸より嫌気培養しKm耐性菌を分離したが、導入遺伝子保持菌は検出されなかった。保持菌比率は10-5以下であった。
死んだ遺伝子導入魚から導入遺伝子が出てくる可能性についても検討した。死んだ直後の組織及び7日後の腐敗組織から好気培養した菌を比較すると、後者のほうがKm耐性菌数が多かった。しかし、死んだ直後と7日後のどちらのKm耐性菌にも、導入遺伝子保持菌は検出されなかった。保持菌比率は10-3〜10-6以下であった。さらに、霞ヶ浦湖水マイクロコズム中に放置した導入遺伝子ゼブラフィッシュから周辺の微生物への移行を検討した。死んだ遺伝子導入魚及び野生型魚を添加した霞ヶ浦湖水マイクロコズムの培養液を好気培養した結果、両条件でKm耐性菌数は同程度であり、それぞれ経時的な増加が見られたが、導入遺伝子保持菌は検出されなかった。保持菌比率は10-3〜10-4以下であった。
(2)遺伝子組換え植物の導入遺伝子の環境拡散リスクと植物多様性影響評価に関する研究
�ー�生集団内および集団間における遺伝子移行の評価法の開発−１．他殖性作物について
植物における集団内・集団間遺伝子流動に及ぼす生殖様式の影響を明らかにするために、典型的な他殖性植物である普通ソバおよび同種の自殖系統をナタネのモデル植物として用いて(1)集団内、集団間遺伝子流動の実態把握を行った。また、拡散リスク評価法の確立を目指して(2)アズキと野生種のツルマメのQTL情報（長さ、重さ、数などの量的性質の発現に関与する遺伝子座の位置）に基づいた適応度を考慮した組換え遺伝子拡散のシミュレーションモデルの構築を試みた。遺伝子流動の把握では、他殖性普通ソバと他殖性普通ソバからの育成系統である自殖性普通ソバとの生殖様式の違いが集団内遺伝子流動におよぼす影響、ならびに個体ごとの開花期が集団内遺伝子流動に及ぼす影響に着目した。
自殖性普通ソバの花器構造は他殖性普通ソバと変わらず、厳密な意味での自殖性というよりは他殖も可能な自家和合性であり、ナタネのモデルとなりえる。他殖性の場合には、方角によるバラツキがあるものの、近傍の20％から15m先でも5％の結実率と緩やかに減少する遺伝子流動が見られたが、自殖性においては花粉親と接している近傍個体でもわずか3％の結実率であり、6ｍ離れると0.2%、それ以上では遺伝子流動はほとんど認められなかった。このことは、自家和合性の付与は個体間遺伝子流動を非常に強く制約することを示唆している。また開花期の違いが遺伝子流動に及ぼす影響については、開花期間は重なっていても開花始が2週間違うだけで遺伝子交換は妨げられることが明らかになった。QTL情報を用いたモデル構築による遺伝子組換え作物の環境拡散リスク評価手法の確立を目指して、その基本モデルを構築し、シミュレーションを行った。その結果、適応関連遺伝子座近傍に遺伝子が導入された場合には、該当遺伝子が中立であったとしても連鎖引きずりによって次世代集団内に固定されることが示唆された。
�⊆�生集団内および集団間における遺伝子移行の評価法の開発−２．自殖性作物について
自生集団に組換え遺伝子が拡散する可能性を明らかにするため、日本国内において虫媒による自生集団への遺伝子移行が考えられる代表的作物であるダイズおよびアズキを対象に、遺伝子拡散のモニタリングに利用可能なマイクロサテライトマーカーの開発を行った。その結果、ダイズから野生型であるツルマメ集団およびアズキから野生型であるヤブツルアズキ集団への遺伝子拡散のモニタリングに利用可能なマイクロサテライトマーカーの選抜に成功し、野生種の集団遺伝構造、野生種間の自然交雑、栽培種−野生種間の自然交雑および栽培種から野生種への遺伝子浸透の実態を明らかにした。ダイズおよびアズキともに、栽培種から野生種への自然交雑率は、野生個体間よりも明らかに低かった。アズキでは、栽培種から野生種への遺伝子流動により生じた形態的中間体やその分離後代と考えられる雑種型が頻繁に認められた。その一方で、ダイズでは、近年のダイズとツルマメの自然交雑に由来する形態的中間体は非常に稀であり、しかも自生地環境において短期間のうちに消滅する傾向が認められた。
しかしながら、ダイズでも、雑種や雑種後代が自生地環境で少なくとも数年間は自殖によって繁殖していることが明らかとなった。そのため虫媒の自殖性作物を代表するダイズやアズキでは栽培種−野生種間の自然交雑は稀であっても、自然交雑によって生じた雑種後代は自殖によって繁殖できることから、今後は組換え遺伝子が野生種へ拡散するという前提で研究を進めていく必要がある。
�Ｆ各�遺伝子の近縁野生種への移行頻度に関する研究
遺伝子組換え植物が生物多様性に及ぼし得る影響の一つとして考えられる、導入された遺伝子が、近縁野生種に移行し、野生種集団内で拡散する可能性を解明するため、ダイズとその近縁野生種であるツルマメを材料に用いて以下のような研究を行った。まず、人工交配により遺伝子組換えダイズ（GMダイズ）とツルマメの雑種を作成し、その生理的性質を調べた。F1雑種の種は、大きさや形態がツルマメと似ていたが、それを播種して得られた植物は、成育や形態に関して両親の中間的性質を示した。すなわち葉や植物体の大きさはツルマメに似ていて小さかったが、植物体の形態はダイズと似ていて茎が直立し、つる性を示さなかった。しかし栽培を続けると、途中からつる性を示すようになり、植物体の形態もツルマメと近いものになった。PCRによる解析の結果、この雑種に除草剤耐性遺伝子が存在していることが確認された。更に、F1雑種は、GMダイズと同様に除草剤グリホサートに耐性を示した。また、F1雑種の自家受粉により、F2雑種の種子を得ることができた。それを播種し、同様の方法で幼植物の除草剤耐性の有無を調べたところ、耐性のものと感受性のものがほぼ3:1に出現し、除草剤耐性の形質は優性でメンデル遺伝することがわかった。以上の結果から、GMダイズに導入された除草剤耐性遺伝子が、ツルマメとの交配を通じてF2世代にまで受け継がれ、雑種に除草剤耐性を付与し得ることがわかった。
ついで、在来ダイズ2品種とツルマメを材料に用い、それらの間での自然交雑率について以下のような研究を行った。5月下旬から6月上旬にかけて、開花特性の異なる2品種（主に東北地方で栽培されているリュウホウと西日本で栽培されているフクユタカ）のダイズとツルマメ（那須-5）を温室内で播種し、育苗した。これらを適宜6月中旬から7月中旬にほ場の2区画に以下のように定植した。各区画の中心となる直径2mの円内にダイズの各々の品種を18個体ずつ移植し、その周囲１ｍ間隔で直径10mになるまで円を描き、その円上の8方向にツルマメを1個体ずつ移植し、その後は通常管理で栽培した。播種、定植時期を適当にずらせることによりこれらのダイズ2品種とツルマメの開花時期がかなり重なった。11月にツルマメに形成された鞘を採集し、得られた種子に対し、SSRマーカーを用いて花粉親を同定した。ダイズから1及び2m離れたツルマメ由来の種子2,500粒に対し分析を行った結果、ダイズ由来の花粉で受精したと思われるものは全く検出されなかった。
さらに、5月下旬にダイズ（フクユタカ）、ツルマメ（那須-5）とそれらの間で作成されたF2雑種を温室内で播種し、育苗した。これらを6月下旬にほ場の2区画に以下のように定植した。一方の区画（Ａ）ではダイズ24個体とツルマメ20個体を、また別の区画（Ｂ）ではF2雑種24個体とツルマメ20個体を0.8または1m間隔に交互に隣接させた。その後はこれまでと同様にこれらの植物の生育や開花状況を観察しながら、適宜施肥や農薬散布を行った。このように栽培したダイズの草丈はほぼ揃っていたが、F2雑種とツルマメの草丈は、個体間でのばらつきが大きく、ダイズよりも大きいものが多数観察された。いっぽうそれらの植物の開花時期はほぼ完全に一致した。しかし、ツルマメに形成された鞘を11月に採集し、得られた種子に対し、SSRマーカーを用いて花粉親を同定した結果、Ａ区画から収穫した343粒およびＢ区画から収穫した476粒のツルマメのいずれにおいてもダイズやF2雑種と交雑したと思われる個体はまったく検出されなかった。
�ぐ篥岨勸楾圓傍擇椶拘超�因子の影響に関する研究
遺伝子組換えナタネ（B. napus）から、在来ナタネ（B. rapaまたはB. juncea）への遺伝子拡散の最大リスクを評価するために、重要な要因となる交雑親和性が環境ストレスによりどのような影響を受けるか、また雑種後代の環境適応度等について変化することを明らかにする必要がある。そこで本研究は、様々な環境ストレスを在来ナタネに与え、非組換えナタネであるセイヨウナタネを花粉親として用いた時の交雑親和性および得られた雑種の環境適応度を調査した。
まず、乾燥ストレスや栄養（窒素）欠乏ストレス、または呼吸阻害剤（アジ化ナトリウム）による環境ストレスを与えて交雑親和性の変化を解析した。乾燥ストレスは、微妙な乾燥ストレスの違いを安定して再現することが困難であり、強い乾燥ストレスを加えると植物に大きなダメージを与え、ストレス応答性の遺伝子が多数発現することが明らかとなった。一方、窒素欠乏では遺伝子発現に大きな差異がなかった。アジ化ナトリウム処理は再現性も高く安定した遺伝子発現の差異が見られた。
ついで、在来ナタネの根圏を制御（深型素焼き鉢4号、6号、10号）して蕾受粉による人工交配を行いその交雑親和性ついて検討した。B. rapaでは一莢あたりの種子数において根圏が小さい4号鉢の値が高く、10号鉢へと根圏が大きくなるにつれてその値は低くなる傾向を示した。一方、B. junceaでは、結莢率において根圏が小さい4号鉢の値が高く、10号鉢へと根圏が大きくなるにつれてその値は低くなる傾向を示した。これらの結果から、根圏の制御という環境ストレスを与えると、交雑親和性を検討するために重要な要素となる結莢率および一莢あたりの種子数の値が高まる可能性があるという結果が得られた。また、この交配により得られた雑種を育成し、形態的特性および生育特性等を調査したところ、発芽率については在来ナタネとセイヨウナタネを比較しても変化は見られなかったが、草丈等の生育特性および抽苔性は在来ナタネとセイヨウナタネの中間程度の値を示した。また、雑種の花粉稔性については、在来ナタネやセイヨウナタネよりもかなり低い値を示すものも観察された。従って、在来ナタネとセイヨウナタネのF1雑種の特性としては、その両親種よりも高まることはないと考えられた。
さらに、自然条件下において根圏を制御した在来ナタネと、セイヨウナタネの交雑率および雑種形成率を検討した。また本実験は、在来ナタネを円の中心、その周囲をセイヨウナタネで取り囲むという、自然条件下で起こり得る可能性が低いと思われるセイヨウナタネの個体数および在来ナタネとの交雑が起こりやすい配置と距離を設定し、その最大交雑リスクを予測した。根圏の制御による影響は、その結莢数および一莢あたりの種子数について一定した傾向は見られず、4号〜10号鉢へと根圏が大きくなるとともに植物体も大きくなり、その結莢数・一莢あたりの種子数も比例して高くなった。本実験においてB. rapaから得られた種子の中に莢内で発芽している種子（莢内発芽種子とする）が多数見られた。そこで、この莢内発芽種子と未発芽であった種子（未発芽種子）とをそれぞれフローサイトメーターを用い分析したところ、莢内発芽種子の91.7%がセイヨウナタネとの雑種であると示した。一方、未発芽種子の中で雑種性を示したものは、7.3%であった。自然条件下で得られた種子数は約42000粒と膨大であったため、莢内発芽種子が雑種を示すという現象を用いてB. rapa×B. napusの自然条件下における雑種形成率を推測したところ、約11.5%であった。また根圏サイズ別の雑種形成率についても検討したところ、結莢率や一莢あたりの種子数と同様に、根圏サイズが大きいと植物体も大きくなりそれに比例して雑種形成率も高くなっていくことが判った。従って、自然条件下における根圏の制御の影響は極めて低いものと考えられた。
さらに、B. juncea（黄からしな）とB. napus（イスズナタネ）の人工交配から得られた種子についても特徴的な傾向がみられた。黄からしなの種子は黄色、イスズナタネの種子は濃茶色であるが、得られた種子は約半数の55%が黄色、45%が茶色を示した。茶色のものはRAPD分析を行った結果、雑種であった。通常、F1雑種後代で現れる種皮色は種子親から遺伝するためこの現象はメタキセニアであることが考えられた。また、種子が黄色のものは、RAPD分析でB. junceaと同様のバンドパターンを示した。交配ミスである事も検討したが、その出現数が非常に多かったため偽雑種の可能性が示唆された。この結果から、B. junceaとB. napusの交雑親和性は従来考えられていたよりも高いが、その雑種形成率は低い可能性が示唆された。
以上の結果により、B. juncea×B. napusの交雑親和性はこれまで推測されていたものより高かった。しかし、在来ナタネとセイヨウナタネの交雑で偽雑種等の可能性が示唆されたことから、雑種の形成効率は比較的低いものと推定された。
�ゥ瀬ぅ困肇張襯泪瓩了┝鏝綢紊療�応度に関する研究
ツルマメとダイズの雑種後代の環境適応度を明らかにするため、栽培特性の異なる国内産品種とツルマメとの雑種を人工的に作出し、地理および気候条件の大きく異なる国内3箇所の試験地において、４組み合わせのF1雑種および２組み合わせのF2雑種を栽培し、環境適応度に関する形質の調査を行った。開花期については、両親の開花期が大きく異なっていても、F2雑種後代で交配親のツルマメと開花期が完全に重複する個体が遺伝的に分離することがわかった。このことから、一旦F1雑種が形成されるとツルマメと雑種後代との間で2次的な自然交雑が生じる可能性が示唆された。また、F1雑種の種子生産量は交配親のツルマメと同程度かやや少なくなる傾向が見られたが、F2雑種では、ツルマメと同程度またはそれ以上の種子生産量を持つ個体が出現した。屋外における種子の越冬性には3試験地間の大きな環境の違いよりも、どこで種子が生産されたかが最も影響することが明らかとなった。F1雑種の種子は両親の中間的な値を示したが、F2雑種ではツルマメと同程度の越冬性をもつような黒色や茶色の種皮をもつ個体が出現した。調査した雑種の個体数が決して多いとはいえないものの、ダイズとツルマメの雑種後代ではツルマメの種子生産性を超えるものや、ツルマメと同程度の越冬性種子をつくるものが遺伝的に分離してくることが明らかとなった。本研究によって得られたダイズとツルマメの雑種後代の適応度に関する知見は組換え遺伝子の定量的拡散リスク評価法の開発に活用されることが予定されている。
(3)組換え生物の生物多様性への総合的影響評価手法の開発
本研究の成果ならびに文献調査から、組換え生物の生物多様性への影響評価に際しての評価項目として、微生物では導入遺伝子の伝達性の有無と頻度、導入遺伝子の濃度と生残性、受容体の濃度、環境条件が重要であり、植物では、生殖形態、開花時期、野生種との栽培距離、雑種後代の適応性、昆虫の存在、QTL解析が重要であることを明らかにした。
４．考察
微生物に関しては、環境浄化を目的として、環境中へ有用な微生物を導入することが現在期待されている。しかしながら、環境中には多種多様な微生物が存在しており、導入した微生物のみを検出、定量することは極めて困難であった。最近、分子生物的な手法による計数法が開発されつつあるが、感度と特異性が低く実用化には程遠い。本研究において、TCE分解微生物を追跡することができる手法が確立できた。すなわち、宿主の染色体、プラスミド、およびプラスミド上の機能遺伝子に、緑色及び赤色蛍光を発するタンパク質ならびに遺伝子を修飾する手法を適応した。この3種のマーカー遺伝子を追跡することによって、環境中に放出された組換え微生物の挙動を視覚的、遺伝学的に追跡することが可能となり、精度の高い研究が可能となった。今後はこのようなモデル菌株を利用した解析を通じ、これまで解明が非常に困難であった環境中での微生物挙動に対する重要な知見が得られるものと考えられる。本研究により開発した技術は環境浄化などに用いられる多くの種類の微生物に利用可能であり、病原菌の解析や遺伝子組み換え微生物の管理などに役立つものとなろう。
本研究で開発した組換え微生物の生物多様性への影響評価法を用いて、水銀化合物浄化菌の微生物多様性への影響を評価した。組換え微生物を接種した系での微生物多様性は、非組換え微生物接種系あるいは無接種の対照系とほとんど異ならないことが示唆された。このことから、本組換え体の微生物多様性への特有の影響は認められなかったが、微生物接種によって増加あるいは減少する環境微生物の存在が確認され、それらの微生物の分離に成功した。これらの分離した微生物が組換え微生物の評価に使用できるかどうかは今後の課題である。
多くの環境中の微生物がプラスミド遺伝子を取り込む能力を有していることが判明したことは大変興味深い。取り込み能は、高い微生物濃度と高いプラスミド濃度のときに生じたものであり、自然環境中の濃度とはかけ離れた高い濃度のために単純に伝達性を評価することはできない。この結果をいかに自然界に適応するかが今後の課題である。また遺伝子の伝達試験で、微生物濃度、遺伝子濃度と伝達頻度とは相関が取れない場合もあった。この理由についても今後検討する必要がある。また、各条件で単離された形質転換体の細菌種は、細菌懸濁液の濃縮倍率によって変化することが示された。これは、試料水原水に低濃度でしか存在しない細菌種の場合は高い濃縮倍率で濃縮して初めて形質転換体が検出できるからと考えられる。
魚からの微生物への遺伝子の移行については、本研究では確認されなかった。pML4プラスミドと大腸菌RR1株を共培養したところ、対数増殖期のRR1約9x108個のなかで、カナマイシン耐性コロニーはまったく現れず、魚の腸内細菌よりも、はるかに形質転換しやすいと考えられるRR1でさえ、pML4プラスミドによる形質転換の頻度は9x108個に１個未満であることが示された。最も形質転換しやすいエレクトロポレーション法を用いても、pML4によるシュードモナスの形質転換の頻度は、シュードモナス2.8x108個のうち１個未満であることが示された。頻度が低いためと考えられるが、検出感度を高める工夫が必要であるが、興味深い課題である。
植物に関しては、組換え体の検出法、遺伝子及び花粉の挙動とモデル化、雑種後代の適合性等の解明を中心に検討を加えた。
花粉媒介昆虫の飛来頻度や結実時の気温など実験環境の差異による影響を考慮しても、自家和合性の付与は個体間遺伝子流動を非常に強く制約することが示唆された。これまでの多くの研究が、別種間での生殖様式の違いの比較であったのに対し、本研究は同一種内での生殖様式の違いが遺伝子流動に及ぼす影響の把握を試みたものであり、遺伝子流動に生殖様式の果たす役割の重要性を明らかにした。
また、アズキ栽培種から自生集団への遺伝子移行が検出できるマイクロサテライトマーカーを明らかにすると共に、複数のマーカーによる遺伝子浸透個体の判別も可能となった。さらに栽培種のアレルが自生集団内に残存する傾向のある遺伝子座が見つかり、アズキの遺伝子浸透個体は過疎化による耕地の放棄などで出現した環境へ進出することで、個体数が増加する傾向が認められた。国内で始めて野生ダイズ自生地において生存する中間型個体を見出した等、多くの遺伝子に関する知見が得られた。
野外でGMダイズとツルマメを近接して栽培し、ツルマメを収穫して自然交雑率を測定したところ、受粉によるダイズからツルマメへの遺伝子移行はまったく起こっていないことが判明した。ダイズとツルマメの間で交雑が全く起こらなかった理由は不明であるが、訪花昆虫があまり観察されず、そのことが主な原因となっている可能性が考えられる。したがって、このような実験による交雑率の評価を行う際には、昆虫が多く存在するような実験場所を選ぶか、それが不明の場合には、複数の場所で実験を行うことが必要であると思われる。また人工交配によりGMダイズとツルマメのF1雑種の種が得られ、さらにその自家受粉によりF2雑種が得られた。F1雑種は、成育や形態に関して両親の中間的性質を示した。またF1、F2雑種には除草剤耐性遺伝子が受け継がれ、除草剤耐性になっていることが確認される等大変興味深い成果が得られた。
集団間・内の遺伝子流動の実態に関しては、開花時期など生態学的要因を加味したうえでDNAマーカーの利用によって把握し、集団間の遺伝子移行のモデル化を行うことを目的として進めてきたが、本研究の成果から、同種における生殖様式の変化が移行に及ぼす影響を定量的に評価でき、モデルのパラメータを与えることができた。また、個々の集団サイズは大きくないが多用な類縁作物種と栽培体系をもつわが国での野外栽培の制限の適正化と効果的なモニタリング手法のデザインを構築することが環境拡散リスク評価には不可欠であるが、本研究の成果により遺伝子浸透を定量的に評価する手法をシミュレーションによって評価することが可能となった。
ダイズやアズキでは栽培種−野生種間の自然交雑は稀であっても、自然交雑によって生じた雑種後代は自殖によって繁殖できることから、今後は組換え遺伝子が野生種へ拡散するという前提で研究を進めていく必要がある。組換え遺伝子が拡散する可能性を高める要因として、栽培種に雑種後代の適応度を高めるような遺伝子が存在する場合が想定される。組換え遺伝子の環境拡散リスクを定量的に評価するためには、本研究で明らかにした野生集団の遺伝構造や他殖率のデータに加え、今後そのような雑種後代の適応度を左右する遺伝子領域に関する情報と自生地における野生種の生活史戦略などの綿密かつ多様なパラメーターを統合し、組換え遺伝子の挙動を把握するためのシミュレーションモデルを構築していくことが欠かせない。
遺伝子の発現、伝播は、各種ストレスにより影響を受けると考えられ、ストレスを与え柱頭における遺伝子発現の差異を検討し、ストレスの種類やかけ方等を検討したところ、乾燥ストレス及び呼吸阻害剤による処理では、各種処理により柱頭における多くに遺伝子の発現が異なることが明らかとなった。
本研究の成果より、組換え生物の生物多様性への影響評価に際しての評価項目として、微生物では導入遺伝子の伝達性の有無と頻度、導入遺伝子の濃度と生残性、受容体の濃度、環境条件が重要であり、植物では、生殖形態、開花時期、野生種との栽培距離、雑種後代の適応性、昆虫の存在、QTL解析が重要であることが明らかとなったが、これらを制御することにより、遺伝子の拡散を著しく抑制することが可能と考えられる。
５．研究者略歴
| 課題代表者:矢木修身 |
| 1943年生まれ、東京大学農学部卒業、農学博士、現在、東京大学大学院工学系研究科水環境制御研究センター教授 |
| 主要参画研究者 |
| （１）��:鎌形洋一 |
| 1958年生まれ、北海道大学大学院農学研究科博士課程終了、工業技術院生命工学工業技術研究所主任研究官、ミシガン州立大学研究員、現在、産業技術総合研究所生物機能工学研究部門生物資源情報基盤研究グループリーダー |
| ��:岩崎一弘 |
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| 1961年生まれ、東京理科大学理工学部卒業、理学博士、現在、（独）国立環境研究所生物多様性研究プロジェクト主任研究員 |
| ��:矢木修身（前出） |
| ��:青木康展 |
| 1954年生まれ、東京大学大学院薬学系研究科博士課程修了、現在、独立行政法人国立環境研究所化学物質環境リスク研究センター室長 |
| （２）��:大澤 良 |
| 1959年生まれ、筑波大学大学院農学研究科修了、農学博士、現在筑波大学大学院生命環境科学研究科助教授 |
| ��:加賀秋人 |
| 1967年生まれ、神戸大学農学部卒業、学術博士、現在（独）農業生物資源研究所遺伝資源研究グループ集団動態研究チーム、主任研究官 |
| ��:佐治 光 |
| 1958年生まれ、京都大学農学部卒業、現在、独立行政法人国立環境研究所生物圏環境研究領域室長 |
| ��:田部井豊 |
| 1958生まれ、宇都宮大学農学部卒業、農林水産省入省野菜試験場入所、農林水産技術会議事務局・先端産業技術研究課現在、独立行政法人農業生物資源研究所新生物資源創出研究グループ 植物細胞工学研究チーム長 |
| ��:加賀秋人（前出） |
| （３）:矢木修身（前出） |
６．成果発表状況
��Kitagawa, W., N. Kimura, and Y. Kamagata (2004), A Novel p-nitrophenol degradation gene cluster from a gram-positive bacterium, Rhodococcus opacus SA0101. J. Bacteriol., 186: 4894-4902.
��Lee, T.H., S. Kurata, C.H. Nakatsu, and Y. Kamagata (2004), Molecular analysis of bacterial community based on 16S rDNA and functional genes in activated sludge enriched with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) under different cultural conditions.
Microbial Ecol., published online.
�４篋螳豺亜¬靆攴た函�2006）、遺伝子組換え微生物の第一種利用における安全性評価、環境バイオテクノロジー学会誌，6: 7-15.
��Kitamoto, N., Ueno, S., Takenaka, A., Tsumura, Y., Washitani, I. and Ohsawa, (2006), Effect of flowering phenology on pollen flow distance, and the consequences for spatial genetic structure within a population of Primula sieboldii (Primulaceae). Amer. L. Bot., 93: 226-233.
��Ueno, S.,Kitamoto, N., Ohsawa, R., Tsumura, Y. and Washitani, I. (2005), Nine additional microsatellite markers for Primula sieboldii E. Morren, Conservation Genetics Technical Notes, 6: 1063-1064.
��Iwata, H., Imon, K., Tsumura, Y. and Ohsawa, R. (2005), Genetic diversity among common buckwheat (Fagopyrum esculentum) cultivars in Japan as determined from AFLP and SSR markers and quantitative agronomic traits. Genome, 48: 367-377.
��Kitamoto, N., Honjo, M., Ueno, S., Takenaka, A., Tsumura, Y., Washitani, I. and Ohsawa, R., (2005)Spatial genetic structure among and within populations of Primula sieboldii growing separate streams. Mol. Ecol. 14:149-157.
��北本尚子、上野真義、津村義彦、鷲谷いづみ、大澤良（2005）、絶滅危惧植物サクラソウ（Primula sieboldii）におけるマイクロサテライトマーカーの開発、保全生態学研究，10: 47-51.
��Kuroda, Y., A. Kaga, N. Tomooka, D.A. Vaughan (2006), Population genetic structure of Japanese wild soybean (Glycine soja) based on microsatellite variation, Molecular Ecology, 15: 959-974.
��A. Kaga, D.A. Vaughan and N. Tomooka. In H. Lorz and G. Wenzel (eds.) (2004), Molecular markers in plant breeding and crop improvement, Biotechnology in Agriuclture and Forestry, 55: 171-187.
��Han, O. K., A. Kaga, T. Isemura, X.W. Wang, N. Tomooka, D.A. Vaughan (2005), A genetic linkage map for azuki bean [Vigna angularis (Willd.) Ohwi and Ohashi], Theor. Appl. Genet., 111: 1278-1287.
��Wang, X.W., A. Kaga, N. Tomooka and D.A. Vaughan (2004), The development of SSR markers by a new method in plants and their application to gene flow studies in azuki bean [Vigna angularis (Willd.) Ohwi & Ohashi], Theor. Appl. Genet., 109: 352-360.
��Zong, X.X., A. Kaga, N. Tomooka, X.W. Wang, O.K. Han and D. Vaughan (2003), The genetic diversity of the Vigna angularis complex in Asia, Genome, 46: 647-658.
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