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[Ｆ−７ 遺伝子組換え生物の開放系利用による遺伝子移行と生物多様性への影響評価に関する研究]
（１）遺伝子組換え微生物の微生物多様性への影響評価手法の開発に関する研究
� ．沺璽�ー遺伝子を導入した組換え微生物の検出法の開発
独立行政法人産業技術総合研究所
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生物資源情報基盤研究グループ
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鎌形洋一・木村信忠・花田 智
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<研究協力者>
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諸野祐樹
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[平成15〜17年度合計予算額]
平成l5〜17年度合計予算額 23,869千円
(うち、平成17年度予算額 7,866千円)
※上記の予算額には、間接経費 5,509千円を含む
［要旨］
国内において現在までに実用化されている組換えDNA技術として、酵素、医薬品の生産などの閉鎖系において利用されている例が数多くあるが、環境中などの開放系利用においては実用化されている例は未だに存在しないのが現状である。一方、研究段階では環境浄化を目的とする組換え微生物が現段階で創製されており、実用化が期待されている。しかしながら、環境中に解放した微生物の生残性や浄化活性を長期間に渡ってモニタリングする手法はまだ確立しておらず、環境中に存在する多種多様な微生物の中から導入した微生物のみを検出、定量することは極めて困難である。そこで、汚染物質を分解する性質を付与した組換え微生物に、標識（マーカー）となるような特徴的な配列、及び遺伝子を導入し、環境中、特に類似の微生物や遺伝子が存在する状況においても特異的検出、及びその動態の追跡が可能となる手法の確立を目指した。
まず、大腸菌を用いて微生物の16S rRNA遺伝子にオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子（gfp）を相同組換えによって導入する手法を開発した。続いてトリクロロエチレンを分解する性質が知られているトルエン-2-モノオキシゲナーゼ遺伝子を対象に、同義置換によって野生型遺伝子と区別可能な配列（マーカー配列）を挿入する技術を開発、導入を行った。このマーカー配列はPCRによって野生型の存在下でも特異的に検出可能であった。一方、プラスミドには造礁サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質遺伝子（dsred）を挿入することによってプラスミドの有無を検出可能とした。これらの技術を応用し、TCE分解微生物としてPseudomonas putida KT2440株を宿主とした組換え体を作成した。この組換え体は、宿主を緑色蛍光、プラスミドを赤色蛍光で検出可能であった。また、機能遺伝子はマーカー配列によって類似遺伝子の中でも定量PCR等を用いて特異的に検出、定量が可能であった。加えてgfp、dsredの各遺伝子を定量する系についても合わせて作成し、環境中へ導入した組換え体の複合的かつ特異的検出、定量手法を開発することができた。
［キーワード］
環境浄化、微生物の検出定量、蛍光タンパク質遺伝子、16S rRNA遺伝子、組み換え微生物の管理
(2.49MＢ)
