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［ｷｰﾜｰﾄﾞ］複合微生物、微生物定量技術、16SrRNA、DNAﾌﾟﾛｰﾌﾞ、RNase H
[ＲＦ－０７６ 複合微生物解析による環境質評価のための迅速・網羅的微生物検出・定量技術の開発]
（１）迅速・網羅的微生物検出のための基盤技術の開発に関する研究
[PDF](1,902KB)
独立行政法人産業技術総合研究所
生物機能工学研究部門
バイオメジャー研究グループ
関口勇地
[平成19～20年度合計予算額] 8,805千円（うち、平成20年度予算額 4,255千円）
［要旨］
環境浄化のための遺伝子組換え微生物第一種利用時や、外来微生物を利用したバイオレメディエーションにおける環境動態解析や環境影響評価（微生物群集への評価）において、特定の微生物群とそれを取り巻く複合微生物群を定性・定量的に解析する緊急の必要性が生まれている。しかしながら、そのような複合微生物群を培養法に依存することなく迅速、簡便かつ網羅的に定性・定量するための技術は十分に確立されておらず、その基盤研究と技術の整備が急務となっている。本研究課題では、日本発の分子生物学的微生物定量技術であるRNase H法を発展、応用し、環境動態解析や環境影響評価のための複合微生物解析技術を開発することを目的とした。平成19年度はRNase H法の高度化を促進するための技術開発を行った。具体的には、反応の迅速化と簡便化、および耐熱性RNase Hの使用による切断条件や性能の評価を行い、より簡便で高効率な技術に改変した。また、生物由来SSU（small-subunit） rRNA全てを切断するユニバーサルプローブ、およびバクテリア、アーキアの16S rRNAを切断する条件をプローブの選択と切断条件を決定した。また、それらのプローブを利用したrRNAの3’末端蛍光標識化技術の検討を開始した。これらの結果は2009年4月発行の論文に掲載された。また、O-メチル化DNAプローブを利用してrRNAの切断効率を高められることが実験的に証明され、RNase H法をさらに高度化できることが示された。RNase HとO-メチル化DNAプローブを利用した配列特異的3’末端蛍光ラベル化法を確立し、RNase H法と配列特異的蛍光ラベル化法を組み合わせた方法で特定rRNA量の定量を行った。その結果、0.5-100%の混合率と定量値との間に高い定量性（直線性）が見られた。本手法においては、特定のRNA配列のみを蛍光標識化しているため、他のRNAが大量に混入するような試料での定量において有効であることが示された。これらの結果は、従来のRNase H法をより高度化した結果であると共に、今後の複合微生物由来RNA定量技術の高感度化の基盤情報を提供するものである。
